การตรวจเชื้อ Xanthomonas campestris pv.Vesicatoria สาเหตุโรคใบจุดแบคทีเรียของมะเขือเทศ โดยใช้เทคนิค Polymerase ChainReaction
ปิยรัตน์ ธรรมกิจวัฒน์, ชลธิชา รักใคร่, ณัฎฐพร อุทัยมงคล และศรีวิเศษ เกษสังข์
รายงานผลงานวิจัยเรื่องเต็มปี 2548. สำนักวิจัยพัฒนาการอารักษาพืช กรมวิชาการเกษตร กระทรวงเกษตรและสหกรณ์. 2549. 1820หน้า.
2549
บทคัดย่อ
ประเทศไทยเป็นประเทศมีศักยภาพในการเป็นแหล่งผลิตเมล็ดพันธุ์ เพื่อการส่งออกที่สำคัญ จึงจำเป็นต้องมีเทคนิคการตรวจสุขภาพเมล็ดพันธุ์เพื่อป้องกันการติดมาของเชื้อสาเหตุของโรคที่สำคัญ ทั้งนี้ในขั้นตอนการผลิตเมล็ดพันธุ์ลูกผสมต้องนำเข้าเมล็ดพันธุ์พ่อ-แม่จากต่างประเทศ และก่อนการส่งออกเมล็ดพันธุ์ต้องมีการตรวจรับรองการปลอดโรคกับพืช ตลอดช่วงการเจริญเติบโตในแปลงปลูก และตรวจรับรองเมล็ดพันธุ์หลังการเก็บเกี่ยว จึงเป็นต้องพัฒนาและปรับใช้เทคนิค การตรวจเชื้อที่ให้ผลแม่นยำและรวดเร็ว การพัฒนาเทคนิคการตรวจเชื้อ Xanthomonas campestris pv.Vesicatoria(Xcv.) สาเหตุโรคใบจุดแบคทีเรียมะเขือเทศ ด้วยเทคนิค polymerase chain reaction (PCR) โดยทดสอบไพรเมอร์ในการสังเคราะห์เพิ่มปริมาณชิ้นดีเอ็นเอที่จำเพาะต่อเชื้อ พบว่าไพรเมอร์ RST9 (5’GGCACTATGCAATGAC TG3’)และ RST10 (5’AATACGCTGGAACTGCTG3’) ให้ผลของปฏิบัติกิริยา PCR เป็นบวก สามารถสังเคราะห์เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอขนาด 355 base pairs (bp) มีความไวในตรวจเชื้อที่ความเข้มข้นของ ดีเอ็นเอและเซลล์แขวนลอยเชื้อ 1นาโนกรัม และ 106 cfu/ml ตามลำดับ เมื่อทดสอบความจำเพาะในการตรวจเชื้อพบว่าเชื้อ Xcv. บางสายพันธุ์มีการสร้างสายดีเอ็นเอมากกว่าหนึ่งแถบ (multiple bands) ซึ่งอาจทำให้การวิเคราะห์ผลการตรวจสอบเชื้อผิดพลาดได้ ในการวิจัยนี้จึงได้ทำการพัฒนาไพรเมอร์ใหม่ โดยการเปรียบเทียบแถบดีเอ็นเอที่สังเคราะห์ได้ จากไพรเมอร์ RST9 และ RST10 พบว่าเชื้อ Xcv.ส่วนใหญ่ให้แถบ ดีเอ็นเอขนาด 355 bp ที่เด่นชัดเจน จึงทำการโคลนสายดีเอ็นเอและวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ พบว่าสายดีเอ็นเอมีขนาด 356 base เมื่อเปรียบเทียบลำดับนิวคลีโอไทด์กับฐานข้อมูลของ EMBL-EBI พบว่ามีความเหมือน 97% (355 bp) กับบริเวณ hrp gene ของเชื้อ X. campestris pv.Vesicatoriaสายพันธุ์ XC33548 ใช้โปรแกรมวิเคราะห์การออกแบบไพรเมอร์ใหม่ สังเคราะห์ไพรเมอร์ และทดสอบปฏิกิริยา PCR พบว่าไพรเมอร์ XCVF2 (5’GAAGCGTTCGTGCTGCAGGA3’) และ XCVR2 (5’GGAACTGCTGACCA GCGTGA3’) ให้ผลของปฏิกิริยา PCR เป็นบวก สามารถสังเคราะห์เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอของเชื้อ Xcv. ได้แถบดีเอ็นเอแถบเดียวมีขนาด 270 bp จากเชื้อทุกสายพันธุ์ โดยมีความไวในการตรวจเชื้อ Xcv. ที่ความเข้มข้นต่ำสุดของดีเอ็นเอ และเซลล์แขวนลอยเชื้อที่ 1นาโนกรัม และ 106 cfu/ml ตามลำดับ เมื่อทดสอบความจำเพาะกับเชื้อ X. campestrispathovars อื่นๆ พบว่าปฏิกิริยา PCR สามารถสังเคราะห์เพิ่มปริมาณดีเอ็นเอจากเชื้อ X. campestris pv.dieffenbachiae และ X. campestris pv. citri โดยไม่ทำปฏิกิริยากับเชื้อ X. campestris pv.campestris